Madin-Darby canine kidney (MDCK) Zellen sind eine gängige Wirtszelllinie für die Herstellung zellkulturbasierter Influenza-Impfstoffe. Diese Zellen sind permissiv für ein breites Spektrum von Influenza-Viren und produzieren hohe Virustiter. In einer vorangehenden Proteomstudie unserer Arbeitsgruppe zeigte sich jedoch, dass Mx1 (myxovirus resistance protein 1) in Influenza-virusinfizierten MDCK-Zellen stark induziert wird. Die Induktion von Mx1 ist ein allgemein anerkannter Marker für Interferonaktivität. In der Literatur ist die Interferonantwort der Wirtszellen als starker inhibitorischer Faktor für die Influenza-Virusreplikation beschrieben. In dieser Arbeit sollte daher der limitierende Einfluss dieser Interferonantwort auf die Influenza-Virusausbeute in der MDCK-zellkulturbasierten Impfstoffproduktion untersucht werden.

Als erstes wurden die Induktion von Interferon (IFN) und die nachfolgende Aktivierung des IFN-induzierten Mx1 für verschiedene Influenza-Virusstämme untersucht. Durch A/PR/8/34-delNS1  ein Virusstamm, dem der IFN-Antagonist NS1 (nonstructural protein 1) fehlt  wurden IFN-? und Mx1 stark induziert. Für die Impfstoffproduktion werden gegenwärtig aber Wildtypstämme oder High Growth Reassortanten verwendet, die über NS1 verfügen. Von den in dieser Arbeit untersuchen Wildtypstämmen zeigte nur PR8-NIBSC eine deutlich messbare Mx1-Aktivierung, wogegen alle anderen die IFN-Antwort nur schwach induzierten. Hohe Mengen nicht-infektiöser, „defective interfering“ Viruspartikel (DI-Partikel) im PR8-NIBSC Saatmaterial waren für die vergleichbar starke IFN-Induktion durch diesen Virusstamm verantwortlich. Wurde der Anteil DI-Partikel durch Passagieren von PR8-NIBSC bei geringer MOI (multiplicity of infection) reduziert, verringerte sich auch die IFN-Induktion. Solange also NS1-kompetente Virusstämme verwendet werden und das Auftreten großer Mengen DI-Partikel vermieden wird, ist bei der Impfstoffproduktion in MDCK-Zellen nur eine schwache Aktivierung der IFN-Antwort zu erwarten.

Entsprechend sollte die IFN-Antwort die Replikation von Wildtypstämmen nur in geringem Maße hemmen. Tatsächlich verbesserte eine Unterdrückung der IFN-Antwort durch transiente Überexpression viraler IFN-Antagonisten (Influenza A/PR/8/34 NS1 oder Tollwutvirus Phosphoprotein) nur die Virusreplikation von PR8-delNS1, nicht jedoch von Wildtypstämmen. Diese Beobachtung traf für unterschiedliche MOIs zu. Von unserer Arbeitsgruppe wurden mehrere Ursachen für diesen ungewöhnlich geringen, inhibitorischen Einfluss der IFN-Antwort in MDCK-Zellen ermittelt. So zeigt diese Doktorarbeit, dass das bei der Impfstoffproduktion verwendete Trypsin (pankreatisches Trypsin aus Schweinen, Konzentration 5 BAEE U/mL bzw. 4,5 µg/mL) effektiv IFN proteolytisch abbaut und auf diese Weise die IFN-Antwort reduziert. Trypsin wird bei der Impfstoffproduktion zur Spaltung des viralen Hämagglutinins eingesetzt. Influenza-Viren sind erst nach HA-Spaltung infektiös, so dass Trypsin bei geringer MOI die Ausbreitung der Infektion in mehreren Infektionswellen auf alle verfügbaren Zellen („multi-cycle replication“) ermöglicht. In dieser Arbeit wurden bei Verzicht auf Trypsinzugabe eine stärkere IFN- und Apoptoseinduktion sowie geringere Virustiter beobachtet. Gleichzeitig verzögerte die Abwesenheit von Trypsin den Infektionsverlauf, jedoch fand trotzdem noch multi-cycle Virusreplikation statt. Eine unvollständige Infektion aller Zellen konnte daher als Ursache für die geringeren Virustiter in Abwesenheit von Trypsin ausgeschlossen werden. Dagegen verbesserte eine transiente Überexpression viraler IFN-Antagonisten in Abwesenheit von Trypsin den Titer für delNS1 deutlich. Weiterhin konnten durch eine trypsinunabhängige Beschleunigung des Infektionsverlaufs auch in Abwesenheit von Trypsin trotz stärkerer IFN-Induktion nahezu dieselben Virustiter erreicht werden wie mit Trypsin beobachtet. Entsprechend verhindert Trypsin wahrscheinlich auf zweierlei Weise einen limitierenden Einfluss der IFN-Antwort auf die Influenza-Impfstoffproduktion in MDCK-Zellen. Zum einen bleibt durch den schnellen Infektionsfortschritt in Anwesenheit von Trypsin nicht genügend Zeit zum Aufbau der IFN-induzierten, antiviralen Abwehrmechanismen der Wirtszellen. Zum anderen reduziert trypsinvermittelter, proteolytischer IFN-Abbau die IFN-Signaltransduktion.

Zusammenfassend beugen die aktuell verwendeten Prozessbedingungen bei MDCK-zellkulturbasierter Influenza-Impfstoffproduktion einem negativen Einfluss der IFN-Antwort auf die Virusausbeuten vor. Durch Verwendung NS1-kompetenter Impfstämme wird IFN bei der Virusinfektion nur schwach induziert. Gleichzeitig verhindern trypsinvermittelter IFN-Abbau und schneller Infektionsfortschritt einen inhibitorischen Effekt der verbleibenden IFN-Antwort auf die Virusreplikation.

Forschungsberichte aus dem Max-Planck-Institut für Dynamik komplexer technischer Systeme